Άρθρο από την ιστοσελίδα του Lorenzo Lucantonio, Γενετιστή–Μοριακό Βιολόγο

1. Εισαγωγή

Η γονιδιωματική είναι μέρος των «επιστημών omics» και ασχολείται με τη μελέτη του γονιδιώματος. Για να γίνει αυτό κάνει χρήση της βιοπληροφορικής και των τεχνικών μοριακής βιολογίας.

Η μελέτη της γονιδιωματικής στοχεύει κυρίως στην αλληλουχία του γονιδιώματος και την κλωνοποίηση γονιδίων, επιτρέποντας έτσι την παρατήρηση γονιδιακών μεταβολών και τη μελέτη τους σε απλούστερα μοντέλα. Οι τεχνικές μελέτης που χρησιμοποιούνται στη γονιδιωματική είναι πολλές και συχνά πρέπει να ενσωματωθούν μεταξύ τους για να έχουν ένα καλύτερο αποτέλεσμα.

2. Η αλληλουχία του γονιδιώματος
Η αλληλουχία γονιδιώματος είναι μια μέθοδος που χρησιμοποιείται στο εργαστήριο για τον προσδιορισμό της ακολουθίας νουκλεοτιδίων ενός μορίου DNA. Η μέθοδος αναπτύχθηκε από τον Frederick Sanger το 1975 και απέσπασε το Βραβείο Νόμπελ Χημείας το 1980, εξ ου και ο όρος Μέθοδος Sanger.
Η τεχνική αυτή βασίζεται στη χρήση τροποποιημένων νουκλεοτιδίων (ddNTPs) που παράγονται τεχνητά και επισημαίνονται ραδιενεργά ή με φθορισμό. Αυτά λόγω της ελλείπουσας δομής της ομάδας 3′ υδροξυλίου, εμποδίζουν ένα άλλο νουκλεοτίδιο να δέσει στην αντίδραση πολυμερισμού εμποδίζοντας το σχηματισμό του φωσφοδιεστερικού δεσμού, την βασική δομή του μορίου του DNA.

Γέλη αλληλουχίας DNA

Όπου έχουν ενσωματωθεί τα ddNTPs, η αντίδραση πολυμερισμού σταματά πριν από την επίτευξη του τέλους της αλληλουχίας του πρότυπου DNA. Σε αυτό το σημείο θα έχουμε μια σειρά από θραύσματα DNA διαφορετικών μηκών που διακόπτονται στα ddNTPs που ενσωματώνονται και ακριβώς αυτή η διακοπή, χάρη στη βοήθεια μιας ηλεκτροφόρισης, θα αποκαλύψει ποια βάση βρίσκεται στο συγκεκριμένο σημείο.

Οι τεχνικές αλληλούχισης επόμενης γενιάς (NGS) χρησιμοποιούνται επίσης συχνά, και περιλαμβάνουν τη χρήση εργαλείων τελευταίας τεχνολογίας που καθιστούν δυνατή την αλληλούχιση ενός ολόκληρου γονιδιώματος σε πολύ σύντομο χρονικό διάστημα σε σύγκριση με την κλασική μέθοδο Sanger.

Το NGS είναι μια μέθοδος που λειτουργεί “κατ ‘επέκταση” (σε αντίθεση με τη μέθοδο Sanger που χρησιμοποιεί διακοπές), αυτό σημαίνει ότι, όταν προστίθεται ένα νέο νουκλεοτίδιο στο εκκολαπτόμενο σκέλος του DNA μέσω της αντίδρασης πολυμερισμού, το τελευταίο εκπέμπει ένα συγκεκριμένο σήμα φθορισμού για κάθε νουκλεοτίδιο που ανιχνεύεται αμέσως από το μηχάνημα.

Ωστόσο, υπάρχουν πρακτικοί περιορισμοί στη χρήση τους: τα μηχανήματα που επιτρέπουν αυτόν τον τύπο αλληλούχισης χρειάζονται πολύ ισχυρούς επεξεργαστές που δεν μπορούν να αντέξουν οικονομικά όλα τα εργαστήρια και προσωπικό υψηλής ειδίκευσης για τη χρήση τους.

Για αυτό τον λόγο, παρά το γεγονός ότι είναι μια πιο προηγμένη μέθοδος, σίγουρα δεν είναι τόσο διαδεδομένη.

3. Λειτουργική Γονιδιωματική

Η λειτουργική γονιδιωματική, όπως υποδηλώνει και το όνομα της, ασχολείται με τη μελέτη της λειτουργίας και των αλληλεπιδράσεων των γονιδίων με τα προκύπτοντα πρωτεϊνικά προϊόντα.

Η πιο χρησιμοποιούμενη μέθοδος είναι σίγουρα αυτή του DNA Microarray που παρέχει:

  • τη χρήση ανιχνευτών DNA προσαρτημένων σε στερεά επιφάνεια (συχνά γυάλινη) που αντιπροσωπεύει τη συστοιχία (μήτρα)·
  • τις αλληλουχίες ενδιαφέροντος που λαμβάνονται χάρη στη μετατροπή των mRNAs σε cDNA από το ένζυμο αντίστροφης μεταγραφάσης.

Τα cDNAs σε αυτό το σημείο τοποθετούνται πάνω στη μήτρα και, χάρη στους νόμους της συμπληρωματικότητας των αζωτούχων βάσεων του DNA, θα υβριδοποιηθούν με τους ανιχνευτές.

4. DNA Microarray

Με την υβριδοποίηση και μετά τον καθαρισμό της πλεονάζουσας μήτρας, θα είναι δυνατό, με την αυτοραδιογραφία, να απεικονιστεί το σήμα που εκπέμπεται από τους ανιχνευτές υβριδισμού.

Όπου υπάρχει υβριδοποίηση μεταξύ της ακολουθίας ενδιαφέροντος και του ανιχνευτή υβριδισμού, θα υπάρχει ένα ελαφρύ σήμα του οποίου η ένταση θα καθορίσει την περισσότερο ή λιγότερο έντονη την παρουσία της υβριδοποίησης.

Το DNA Microarray είναι μια τεχνική όπου διαχρονικά έχουν αναπτυχθεί ευρείες χρήσεις τόσο στον τομέα της βασικής έρευνας όσο και στην ιατρική διάγνωση.

Στον τελευταίο τομέα χρησιμοποιείται για γενετικές ασθένειες όπου, η γονιδιακή έκφραση των νοσούντων κυττάρων συγκρίνεται με εκείνη των υγιών κυττάρων προκειμένου να εντοπιστεί η αλλοίωση του μεταλλαγμένου γονιδίου.

5. Συγκριτική Γονιδιωματική

Η συγκριτική γονιδιωματική καθιστά δυνατή τη σύγκριση των ομοιοτήτων και των διαφορών στο γονιδίωμα διαφορετικών οργανισμών και την κατανόηση σε μοριακό επίπεδο του τι διακρίνει το ένα είδος από το άλλο.

Σε εξελικτικά πολύ στενά είδη, η σύγκριση των γονιδιωμάτων τους καθιστά δυνατή την κατανόηση των γονιδίων που διατηρούνται.

Έτσι μπορούμε να «δούμε» και να κατανοήσουμε, εκείνα τα γονίδια που διαθέτουν τις πληροφορίες για τα πρωτεϊνικά προϊόντα και είναι απαραίτητα για την ορθή κυτταρική λειτουργία και τα οποία κατά τη διάρκεια της εξέλιξης έπρεπε να διατηρηθούν, και εκείνα τα νέα γονίδια, μοναδικά για κάθε είδος, που μας επιτρέπουν να εκτιμήσουμε τις διαφορές που χαρακτηρίζουν τη βιοποικιλότητα.

Στο κλινικό περιβάλλον, για παράδειγμα, αυτό αξιοποιείται με βάση την παρουσία διατηρημένων γονιδίων λοιμογόνου παράγοντα σε πολλά παθογόνα. Γνωρίζοντας ποια είναι αυτά τα γονίδια διευκολύνει την ανάπτυξη θεραπειών που δρουν σε ένα ευρύτερο φάσμα.

6. Οργανισμοί Μοντέλα (ΠΡΟΤΥΠΟΙ)

Η κατανόηση των γονιδίων που διατηρούνται μεταξύ των ειδών είναι χρήσιμη ειδικά στον τομέα της έρευνας.

Στην πραγματικότητα, η διεξαγωγή μελετών σχετικά με τους πρότυπους οργανισμούς μας επιτρέπει να εφαρμόσουμε τις γνώσεις που αποκτώνται μεταφράζοντάς τις σχεδόν στον άνθρωπο.

Ένας οργανισμός μοντέλο επιλέγεται με βάση πολλά χαρακτηριστικά, όπως:

  1. αλληλουχία γονιδιώματος ,
  2. εύκολη συντήρηση σε εργαστηριακές συνθήκες (μέγεθος του οργανισμού και φροντίδα που αυτό χρειάζεται),
  3. απλός και σύντομος κύκλος ζωής, ώστε να έχει αποτελέσματα τόσο στη «νεολαία» όσο και στα «γηρατειά»,
  4. ταχεία διάδοση, ώστε να είναι σε θέση να μελετήσει την επίδραση μιας μετάλλαξης στους απογόνους και να τη διατηρήσει με την πάροδο του χρόνου για αρκετές γενιές.

Οι οργανισμοί μοντέλα είναι πολλαπλοί και επεκτείνονται σε όλους τους τομείς της ζωής και μερικοί από τους πιο χρησιμοποιούμενους είναι:

  1. Ο Βακτηριοφάγος lambda για τη μελέτη των βασικών μεθόδων μόλυνσης από τους ιούς.
  2. Το μικρόβιο Escherichia coli για τη βακτηριακή γενετική και τη μοριακή βιολογία.
  3. Ο Saccharomyces cerevisiae (ζύμη ζυθοποιίας), ο πρώτος ευκαρυωτικός οργανισμός, του οποίου το γονιδίωμα έχει αλληλουχιθεί πλήρως, για τον κυτταρικό κύκλο και τη μελέτη των κυτταρικών οργανιδίων που είναι κοινά σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς.
  4. Arabidopsis thaliana, ο πρώτος φυτικός οργανισμός με αλληλούχιση του γονιδιώματος του, για τη φυσιολογία των φυτών και τη μοριακή βιολογία των φυτών.
  5. Το τρανσπζόνιο Zea mais που επέτρεψε την ανακάλυψη και την κατανόηση των τρανσποζονίων (βρίσκονται διαδεδομένα σε όλα τα θηλαστικά και στον άνθρωπο, όπου οι μεταπηδήσεις τους σχετίζονται με την ανυθρώπινη παθολογία).
  6. Caenorhabditis elegans (νηματώδη) για την αναπτυξιακή βιολογία.
  7. Drosophila melanogaster (η μύγα φρούτων) για την βασική γενετική και την αναπτυξιακή βιολογία.
  8. Mus musculus (ποντίκι) στη βιοϊατρική έρευνα.

Η γνώση που αποκτήθηκε και συνεχώς αποκτάται καθημερινά από τη μελέτη των πρότυπων οργανισμών, μας επιτρέπει να κάνουμε προβλέψεις και να τις εφαρμόσουμε στον άνθρωπο, όπως για παράδειγμα τα μοριακά σύμπλοκα που παρεμβαίνουν στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, του μεταβολισμού, της αναπαραγωγής και της μεταγραφής του DNA κλπ, τα οποία και διατηρούνται ιδιαίτερα σε όλους τους οργανισμούς.

7. Συμπεράσματα

Χάρη στη μελέτη της λειτουργικής γονιδιωματικής και τις τεχνικές αλληλούχισης της μπορέσαμε να αποκρυπτογραφήσουμε τον γενετικό κώδικα και να κατανοήσουμε τη χαρτογράφηση του.

Η αλληλουχία του DNA επέτρεψε στη συνέχεια τη γέννηση συγκριτικής γονιδιωματικής η οποία, χρησιμοποιώντας οργανισμούς μοντέλα, επέτρεψε να αποκτηθούν νέες γνώσεις ρίχνοντας περισσότερο φως στους πολύπλοκους ρυθμιστικούς μηχανισμούς στους οποίους βασίζεται το ανθρώπινο γονιδίωμα.

Βιβλιογραφία

  1. The sequence of sequencers: The history of sequencing DNA – Science Direct
  2. Sequencing technologies and genome sequencing – Journal of Applied Genetics
  3. An Introduction to Functional Genomics and Systems Biology – National Center for Biotechnology Information
  4. Comparison of whole genome sequences provides a highly detailed view of how organisms are related to each other at the genetic level. How are genomes compared and what can these findings tell us about how the overall structure of genes and genomes have evolved? – Articolo su Nature

FGA Center

Το Κέντρο Εφαρμοσμένης Λειτουργικής Γονιδιωματικής διερευνά και προτείνει εξειδικευμένες εξετάσεις της κυτταρικής λειτουργίας.

Επικοινωνία

Online ραντεβού

Για προγραμματισμό τηλεσυνάντησης καλέστε +(30) 210 33 90 340